Wspomnienia magisterskie... PCR w tłumaczeniu Juju.

by Matt Forsythe
|edit 21.07.2015|
Wspomnienia z czasów mojej pierwszej pracy magisterskiej, zabawnie opisane moje zmagania z reakcją PCR i próba laickiego wyjaśnienia co robiłam w labie.

Przeglądając wpisy i decydując o ich dalszej egzystencji miałam nie lada zagwostkę z tym tekstem, który nie co odbiega od pierwotnych ram blogowych. Chociaż z drugiej strony może kiedyś jeszcze się przyda :)

***

"Dziwnie tak wychodzić ostatnim z labu...
Dziś skończyłam po 21.
Mam przeczucie, że chyba odkryłam w czym tkwił problem ^^
po kolejnej próbie kiedy puściłam PCR z gradientem
i na żelu po elektroforezie wyszło kompletne WIELKIE NIC - pusto
- ani jednego maleńkiego prążka z produktem, po za markerem ;(
trzeba było uczynić ruch ofensywny - nazwałam go roboczo Rozbójnikiem XD




 ...ale najpierw małe wyjaśnienie, przypomnienie ;)
Gradient PCR to znaczy wykonanie reakcji w 8-10 próbówkach |w zależności na jakim termocyklerze pracujemy| dla każdej temperatura przyłączania starterów jest inna w zakresie 50-60C - robi się to po to, aby ustalić najlepszą temperaturę, dla której będzie się prowadziło wszystkie inne reakcje PCR z wykorzystaniem tych samych starterów |primerów|.  

Sama reakcja PCR |łańcuchowa reakcja polimerazy| w uproszczeniu jest niczym innym jak "replikacją DNA" w probówce (: masz mieszaninę gdzie kompletujesz wszystkie potrzebne składniki - 4 nukleotydy dNTP, jony magnezowe, bufor, para starterów, które mogą się przyłączyć do każdej z nici DNA po tym jak ulegnie denaturacji w podwyższonej temperaturze i najważniejsza polimeraz termostabilna, która może aktywnie przyłączać nukleotydy i syntetyzować amplifikacyjnie nową nić. Cała reakcja prowadzona jest w termocyklerze ileś zadanych cyklów i dzieli się na 3 etapy -zasadnicze denaturacja nici - rozdzielenie dwuniciowego DNA na dwa, hybrydyzacji gdzie przyłączają się startery, elongacji - polimeraza wstawia komplementarne dNTPsy. Dla każdego etapu jest inna właściwa temperatura. 

Nowa dwuniciowa nić ponownie ulega rozdzieleniu w kolejnym cyklu i następuje kolejne zduplikowanie - zwykle nastawia się około 30 cykli dzięki czemu masz 2 do n-tej materiału gdzie n-jest ilością cykli, które sobie wymarzysz ^^ fajna sprawa otrzymujesz bilion kopi tej samej matrycy. To dlatego wystarczy jedna maleńka kropelka krwi, włos, fragment mikroskopijny naskórka... wszystko w objętościach mikro maleńkiej eppendorfki, aby określić np.: ojcostwo, zbrodniarza, powielić materiał genetyczny do innych badań genetycznych umożliwiających sprawdzenie genów, remdelowanie ich w celu uzyskania nowych genów odpowiadających konkretnym udoskonalonym białkom, lub też badać te, które już funkcjonują w genomie pod kątem mutacji w genach, które je kodują. Przegro możliwości... :)

...ale wracając do dnia dzisiejszego, bo zaraz bajkę na sen napiszę XD
Do Rozbójnika, natchnęła mnie koleżanka z labu. Przejrzała ze mną moją rozpiskę na PCR gdzie podane miałam ilości konkretnych składników i zauważyła istotny błąd.... który mi umknął z braku doświadczenia i przyjmowania wszystkiego za pewnik (gdzieś kiedyś już pisałam o pokorze? i braku rzeczonej).

Koleżanka spostrzegła, że ilość polimerazy jest relatywnie zbyt mała na pojedynczą próbkę o_O
Ja dawałam cały czas 0,15mikrolitra... ilość taka byłaby właściwa, gdy pracowała z 5jednostkową polimerazą (taką ilość podał mi mój pan Doktor na początku dając mi 1 probówkę z odczynnikiem, kiedy się skończyła laborant dał mi kolejną, ale ta polimeraza była już 1-ednostkowa) oj.... przy 1-jednostkowej powinnam na próbkę dać 0,75mikolitra XD.

Drugim dylematem były dNTPsy - miałam podejrzenie, że w czasie przechowywania utraciły swoją aktywność i "rozleciały" od ciągłego rozmrażania i zamrażania na przechowanie...

Mój rozbójnik polegał na tym, iż:
a) pożyczyłam od koleżanki nowe dNTPsy !
b) zwiększyłam ilość polimerazy na 0,75
c) zrobiłam wszystkie 3 polimorfizmy na raz na jedną matrycę od pacjenta nr 64 chorującego na typ suchej wersji AMD ^^ 
d) 32 probówki - 16 dla polimorfizmu A, 16 dla polimorfizmu B-  w tym 8 probówek dla jednej pary starterów definiujący formę dziką i 8 definiujących zmutowaną wersję genu - jeśli w jednej próbce przyłączą się oba rodzaje starterów mamy do czynienia z heterozygotą czyli każdy z alleli genu jest "inny" = mutacja w genie = czynnik mający wpływ na powstawanie AMD 
e) i jeszcze 8 kolejnych dla polimorfizmu C - gdzie 4 z dNTP moimi i 4 z dNTP koleżanki - aby sprawdzić, czy moje działają ^^ polimorfizm C innaczej badam niż A i B - tu po PCR jeszcze się trawi konkretnym enzymem restrykcyjnym w odpowiednim miejscu - jeśli próbka ulegnie takiemu strawieniu - enzym przetnie w spodziewanym miejscu mamy do czynienia z heterozygotą (tak mi się wydaję :P)

całe pokręcenie z tym XD
ale wierzę, że to da odpowiedź dlaczego nie chciało działać, jeśli dalej nic nie będzie wychodzić po tym moim małym autorskim eksperymencie znaczyć będzie, że startery zamówione od dystrybutora syntetyzującego oligonukleotydy dały dupy i nic na to nie poradzę, choćbym nie wiem ile nad nimi dumała :>

lub też zakres temperatury dla rzeczonych starterów jest inny niż ten, w który ja celuję 50-60C
wówczas wszystko trzeba będzie zrobić jeszcze raz dla 40-50, tudzież 60-70.........  o_O
Taka oto zabawa dłubana!"

Brak komentarzy:

Prześlij komentarz